Hra sa začína tým, že sa Chell prebudí v malej presklenej miestnosti, v ktorej je len posteľ, toaleta a rádio. GLaDOS jej povie, že čoskoro sa začne testovanie, a na jednej zo stien sa otvorí oranžový portál. Keď ním hráč prejde, vstúpi do testovacích miestností a začne testovanie. Celkovo je tu 20 testovacích miestností, nazývaných testovacie komory.
Testy začínajú jednoducho. Chell musí zdvihnúť krabice, nazývané Weighted Storage Cubes (skrátene Cubes), a položiť ich na tlačidlá, ktoré otvoria dvere k východu z komory. V tomto momente sa k Chell prihovorí GLaDOS ako sprievodca, pochváli ju a sľúbi jej koláč, keď sa testy skončia. Takmer na začiatku hry Chell získa ručné portálové zariadenie Aperture Science, známe aj ako portálová zbraň. Spočiatku jej Portal Gun vytvára len modré portály a oranžové portály vytvára GLaDOS. Neskôr Chell získa kompletnú Portal Gun a môže vytvárať modré aj oranžové portály.
Testy sú čoraz nebezpečnejšie v ďalšom priebehu hry. V niektorých miestnostiach je na podlahe jed. V iných sú gule elektriny nazývané High Energy Pellets, ktoré zabijú Chell, ak sa ich dotkne. Počas týchto testov je GLaDOS čoraz sarkastickejší a dáva Chell zbytočné rady, ako napríklad: "Podlaha tu ťa zabije. Snaž sa jej vyhnúť." V jednom momente GLaDOS povie Chell, že komora je pokazená a namiesto toho musí prejsť cez komoru plnú strážnych zbraní, nazývaných Turrety. Ak niektorá veža uvidí Chell, bude na ňu strieľať, kým nezomrie. V tejto komore sa nachádza skrytá miestnosť. V skrytej miestnosti sú kresby a nápisy na stenách, ktoré zanechala neznáma osoba. Na nápisoch sú napísané veci ako "koláč je lož" a "vždy sa pozerá" s obrázkom kamery. V neskorších komnatách je takýchto miestností viac.
V ďalšej komore musí Chell na vyriešenie testu použiť kocku Weighted Companion Cube, ktorá vyzerá ako kocka Weighted Storage Cube so srdiečkami. Počas testu GLaDOS niekoľkokrát povie Chell, že Companion Cube nie je živá, ale na konci testu povie Chell, že musí Companion Cube "zabiť", aby sa dostala do ďalšieho testu.
Počas posledného testu musí Chell stáť na pohyblivej plošine. Na konci dráhy plošiny ju to prenesie do ohnivej jamy. GLaDOS poďakuje Chell za vykonanie testov. V poslednej chvíli Chell použije svoju portálovú zbraň, aby unikla z pasce. Pri pokuse o únik z budovy sa Chell dostane do miestnosti, kde nájde GLaDOS. Chell rozbije bielu guľu, ktorá vypadla z GLaDOSu. GLaDOS jej povie, že bola hlúpa, keď ju rozbila, pretože nevedeli, čo to je, ale GLaDOS rýchlo príde na to, že to bolo jej morálne jadro. Povie Chell, že ľudia, ktorí pracovali pre Aperture Science, ho nainštalovali, aby ich prestala zabíjať "smrtiacim neurotoxínom". Keďže ho Chell rozbila, GLaDOS môže Neuro-Toxín opäť používať. Chell má časový limit 6 minút na to, aby zabil GLaDOS skôr, ako Neuro-Toxín zabije Chell. Po odlomení jej častí a ich spálení je GLaDOS zničený a Chell uniká z budovy.
Po úteku Chell omdlie a robot ju vtiahne späť do budovy. Počas titulkov GLaDOS spieva pieseň s názvom "Still Alive" (Stále nažive), ktorú napísal Jonathan Coulton a ktorá hovorí, že aj keď ju Chell zabila, stále žije.
