Usmernená evolúcia
Riadená evolúcia (DE) je metóda používaná na výrobu enzýmov na priemyselné alebo lekárske účely.
Metóda je proteínové inžinierstvo, ktoré napodobňuje prirodzený výber.
Základná myšlienka spočíva v opakovaných kolách mutácie génu, aby sa vytvorila knižnica variantov. Selekciou sa izolujú gény s požadovanou funkciou. Tie sú vzorom pre ďalšie kolo.
Môže sa to robiť in vivo (v živých bunkách baktérií alebo kvasiniek) alebo in vitro (voľne v roztoku alebo v mikrokvapkách).
Testovanie väčšieho počtu mutantov zvyšuje šancu nájsť mutanta s požadovanými vlastnosťami.
Počas evolúcie in vivo sa každá bunka (zvyčajne baktérie alebo kvasinky) transformuje plazmidom obsahujúcim iný člen knižnice variantov. V jednotlivých bunkách sa líši len gén, ktorý je predmetom záujmu, pričom všetky ostatné gény zostávajú rovnaké.
Bunky exprimujú proteín buď vo svojej cytoplazme, alebo na povrchu, kde sa môže testovať jeho funkcia. Tento formát má výhodu výberu vlastností v bunkovom prostredí, čo je užitočné, keď sa má vyvinutý proteín alebo RNA použiť v živých organizmoch.
Ak sa DE vykonáva bez buniek, využíva sa in vitro transkripčný preklad na výrobu proteínov alebo RNA voľne v roztoku alebo v umelých mikrokapôčkach. Výhodou je, že to umožňuje viac podmienok (napr. teplota, rozpúšťadlá). Možno pri nej exprimovať proteíny, ktoré by boli pre bunky toxické. Okrem toho sa pri evolučných experimentoch in vitro môžu vytvárať oveľa väčšie knižnice (až 1015), pretože DNA knižnice sa nemusí vkladať do buniek. To často obmedzuje to, čo sa dá robiť.
Príklad cielenej evolúcie v porovnaní s prirodzenou evolúciou. Vnútorný cyklus znázorňuje tri fázy cyklu riadenej evolúcie s napodobneným prirodzeným procesom v zátvorkách. Vonkajší kruh znázorňuje kroky v typickom experimente. Červené symboly označujú funkčné varianty, bledé symboly označujú varianty so zníženou funkciou
Zabezpečenie dedičnosti
Ak boli izolované funkčné proteíny, je potrebné, aby boli izolované aj ich gény, preto je potrebné prepojenie genotyp-fenotyp.
Môže ísť o kovalentnú formu, keď je gén mRNA na konci translácie spojený s proteínom pomocou puromycínu.
Proteín a jeho gén môžu byť tiež uchovávané spolu alebo v emulzných kvapkách. Izolované sekvencie génov sa potom množia pomocou PCR alebo transformovaných hostiteľských baktérií. Ako templát pre ďalšie kolo mutagenézy sa môže použiť buď jediná najlepšia sekvencia, alebo skupina sekvencií. Opakované cykly diverzifikácia - selekcia - amplifikácia vytvárajú enzýmové variácie prispôsobené procesu selekcie.
Expresný proteín môže byť kovalentne spojený so svojím génom (ako v prípade mRNA), vľavo, alebo môže byť umiestnený v rovnakom priestore s ním, vpravo. V oboch prípadoch je gén, ktorý kóduje proteín, izolovaný
Udelená cena
Americká inžinierka Frances Arnoldová získala Miléniovú cenu za technológiu za priekopníctvo v oblasti riadenej evolúcie.
Otázky a odpovede
Otázka: Čo je to usmernený vývoj?
Odpoveď: Riadená evolúcia (DE) je metóda používaná na výrobu enzýmov na priemyselné alebo lekárske účely. Je to forma proteínového inžinierstva, ktorá napodobňuje prirodzený výber.
Otázka: Ako riadená evolúcia funguje?
Odpoveď: Riadená evolúcia funguje tak, že sa gén podrobí opakovaným kolám mutácie, čím sa vytvorí knižnica variantov. Selekcia potom izoluje gény s požadovanou funkciou, ktoré sa potom použijú ako šablóny pre ďalšie kolo.
Otázka: Kde sa môže uskutočniť cielená evolúcia?
Odpoveď: Riadená evolúcia sa môže vykonávať in vivo (v živých bunkách baktérií alebo kvasiniek) alebo in vitro (voľne v roztoku alebo v mikrokapičkách).
Otázka: Aké sú výhody cielenej evolúcie in vivo?
Odpoveď: Usmernená evolúcia in vivo má výhodu výberu vlastností v bunkovom prostredí, čo je užitočné, keď sa má vyvinutý proteín alebo RNA použiť v živých organizmoch.
Otázka: Aké sú výhody cielenej evolúcie in vitro?
Odpoveď: Usmernená evolúcia in vitro má výhodu v tom, že umožňuje viac podmienok (napr. teplota, rozpúšťadlá) a môžu sa pri nej exprimovať proteíny, ktoré by boli pre bunky toxické. Okrem toho sa môžu vytvárať oveľa väčšie knižnice, pretože DNA sa nemusí vkladať do buniek.
Otázka: Čo obmedzuje to, čo sa môže robiť počas experimentu in vitro?
Odpoveď: Obmedzenie veľkosti toho, čo sa dá urobiť počas experimentu in vitro, je často určené tým, koľko DNA sa musí vložiť do buniek.
