Nukleázy so zinkovými prstami
Nukleázy so zinkovými prstami (alebo ZFN) sú nástrojom používaným na cielenie génov a zmenu DNA. Je to jedna z troch metód zmeny genómu pomocou upravených nukleáz.
Majú dve časti. Zinkové prsty sú umelé molekuly vyrobené z bielkovín a zinku. Každá z nich sa viaže na špecifickú DNA. Nukleázy so zinkovým prstom (ZFN) sú enzýmy získané spojením zinkového prsta s enzýmom na štiepenie DNA nazývaným Fokl. ZFN sa teda naviaže na špecifickú sekvenciu DNA a potom ju na dvoch miestach odstrihne. Bežné bunkové enzýmy zlepia konce dohromady, mínus odstrihnutý kúsok (oprava DNA).
Každý ZFN je určený na použitie na jeden gén, ktorý sa nazýva "cieľový gén" alebo "cieľová DNA". Môžu byť navrhnuté tak, aby pôsobili na špecifické časti génov a vytvorili požadovanú zmenu. Dva typy zmien DNA sú mutácie, ako napríklad delécie a inzercie. Genetický výskum sa zaoberá zmutovanými subjektmi na zvieratách, aby sa zistilo, čo konkrétny gén robí.
3-D znázornenie molekuly zinkového prsta. Zinkové prsty sú označené modrou farbou a zinkový ión je označený zelenou farbou.
Štruktúra zinkového prsta
"Zinkový prst" je názov mnohých proteínových štruktúr. Atóm zinku viaže proteíny a robí ich stabilnejšími. ZFN sa viažu na páry báz DNA. Jeden zinkový prst môže sám o sebe naviazať približne 3 páry báz.
Funkcia ZFN
Nukleázy so zinkovým prstom majú 3-6 zinkových prstov. ZFN majú dve dôležité domény: doménu viažucu DNA a doménu štiepiacu DNA. DNA-cleavage doména využíva enzým nazývaný Fokl, ktorý láme DNA.
ZFN môžu meniť iba sekvencie DNA, pre ktoré sú určené. DNA-viažuca doména sa viaže na špecifickú sekvenciu DNA. Dva ZFN určené pre rovnakú sekvenciu DNA musia zmeniť jeden gén. Domény viažuce DNA sa viažu na obe vlákna dvojitej špirály DNA. Domény štiepiace DNA prerušia reťazec DNA a vystrihnú bázové páry génu. Bunky opravujú prerušené vlákna DNA samy pomocou opravy DNA. Delečné mutácie sú výsledkom chýbajúcich párov báz po oprave DNA.
Dĺžku sekvencie cieľového génu možno tiež špecifikovať. Pomocou 3 zinkových prstov možno zmeniť minimálne 9 párov báz. To je užitočné na odstraňovanie a vkladanie veľmi krátkych sekvencií DNA a určovanie ich vplyvu na cieľový gén. Aj veľké sekvencie možno zmeniť pomocou viac ako jedného ZFN.
Použitie ZFN
ZFN boli použité na odhalenie funkcií génov v mnohých genetických štúdiách. ZFN možno použiť na zmenu DNA akéhokoľvek druhu. Ďalšou vlastnosťou ZFN je, že sa môžu používať in vivo (v živých organizmoch). V súčasnosti sa používajú na modelových organizmoch: rastlinách, hmyze a rybách.
Zoznam organizmov zapojených do výskumu ZFN génových zmien zahŕňa:
- Arabidopsis
- Hovädzí dobytok
- C. elegans
- Kukurica
- Drosophila melanogaster
- Žaby
- Myši
- Ošípané
- Králiky
- Potkany
- Morské ježky
- Hodvábnice
- Sója
- Tabak
- Zebrafish
Problémy s používaním ZFN
Najväčším problémom pri ZFN je náhodná zmena iných génov ako cieľového génu. ZFN sa musí vytvoriť tak, aby našiel správne páry báz na cieľovom géne. Tieto páry báz sa vyberajú tak, aby ich mal len cieľový gén. DNA-cleavage domény fungujú na akejkoľvek sekvencii DNA, takže väzba na nesprávnu sekvenciu génu ju namiesto toho zmení. ZFN, ktoré vyradia bázové páry pre viac ako jeden gén, sa nepovažujú za presné.
Otázky a odpovede
Otázka: Čo je to nukleáza so zinkovým prstom alebo ZFN?
Odpoveď: Nukleázy so zinkovými prstami alebo ZFN sú nástrojom používaným na cielenie génov a zmenu DNA.
Otázka: Aké sú tri metódy zmeny genómu pomocou upravených nukleáz?
Odpoveď: Nukleázy so zinkovými prstami alebo ZFN, nukleázy podobné transkripčným aktivátorom (TALEN) a pravidelne rozmiestnené krátke palindromické repetície (CRISPR) sú tri metódy zmeny genómu pomocou upravených nukleáz.
Otázka: Čo sú zinkové prsty?
Odpoveď: Zinkové prsty sú umelé molekuly vyrobené z proteínu a zinku, ktoré sa viažu na špecifickú DNA.
Otázka: Čo sú nukleázy so zinkovými prstami (ZFN)?
Odpoveď: Nukleázy so zinkovým prstom (ZFN) sú enzýmy, ktoré vznikajú spojením zinkového prsta s enzýmom na štiepenie DNA nazývaným Fokl.
Otázka: Čo sa stane, keď sa ZFN naviaže na špecifickú sekvenciu DNA?
Odpoveď: Keď sa ZFN naviaže na špecifickú sekvenciu DNA, odstrihne ju na dvoch miestach.
Otázka: Čo robia bežné bunkové enzýmy po odstrihnutí DNA?
Odpoveď: Bežné bunkové enzýmy zlepia konce dohromady, bez vystrihnutého kúska (oprava DNA).
Otázka: Aké dva typy zmien DNA môžu vykonať nukleázy so zinkovým prstom alebo ZFN?
Odpoveď: Nukleázy so zinkovými prstami alebo ZFN môžu vykonať dva typy zmien DNA: mutácie, ako sú delécie a inzercie.
