Plynová chromatografia - hmotnostná spektrometria

História

Prvé výskumné práce o chromatografii plyn - kvapalina boli publikované v roku 1950. Chemici používali rôzne detektory, aby zistili, že zlúčeniny vytekajú z konca chromatografu. Väčšina detektorov zničila zlúčeniny, pretože ich spálila alebo ionizovala. Tieto detektory nechávali chemikov hádať presnú identitu každej zlúčeniny vo vzorke. V 50. rokoch 20. storočia Roland Gohlke a Fred McLafferty vyvinuli nový kombinovaný prístroj. Ako detektor v plynovej chromatografii použili hmotnostný spektrometer. Tieto prvé zariadenia boli veľké, krehké a pôvodne obmedzené na laboratórne prostredie.

Návrh bol zložitý. Časový interval medzi jednotlivými zlúčeninami vytekajúcimi z chromatografu bolo ťažké kontrolovať. Hmotnostný spektrometer teda musel dokončiť prácu s jednou zlúčeninou skôr, ako z chromatografu vytiekla ďalšia. V prvých modeloch sa merania z hmotnostného spektrometra zaznamenávali na grafický papier. Vysokokvalifikovaní chemici študovali vzory píkov, aby identifikovali jednotlivé zlúčeniny. V 70. rokoch 20. storočia sa k hmotnostným spektrometrom pridali analógovo-digitálne prevodníky. To umožnilo počítačom ukladať a interpretovať výsledky. Keďže počítače boli stále rýchlejšie a menšie, GC-MS sa zrýchlila a rozšírila sa z laboratórií do každodenného života. Dnes sa počítačové GC-MS prístroje široko používajú pri monitorovaní životného prostredia, vody, vzduchu a pôdy. Využíva sa aj pri regulácii poľnohospodárstva, bezpečnosti potravín a pri objavovaní a výrobe liekov.

Vývoj malých počítačov pomohol zjednodušiť GC-MS stroje. Takisto sa výrazne skrátil čas potrebný na analýzu vzorky. Spoločnosť Electronic Associates, Inc. (EAI) bola popredným americkým dodávateľom analógových počítačov. V roku 1964 začala spoločnosť EAI pod vedením Roberta E. Finnigana vyvíjať počítačom riadený hmotnostný spektrometer. Do roku 1966 sa predalo viac ako 500 prístrojov na analýzu plynov. V roku 1967 bola založená spoločnosť Finnigan Instrument Corporation (FIC). Začiatkom roku 1968 dodala prvé prototypy štvorpólových prístrojov GC-MS na Stanfordovu a Purdueovu univerzitu. Spoločnosť FIC sa nakoniec premenovala na Finnigan Corporation a stala sa svetovým lídrom v oblasti systémov GC-MS.

Základná operácia

GC-MS dokáže nájsť všetky zlúčeniny zmiešané v objekte vzorky. Operátor rozpustí vzorku v kvapaline. Operátor potom vstrekne kvapalinu do prúdu plynu. (Najčastejšie sa používa hélium, vodík alebo plynný dusík.) Plyn prúdi cez trubicu so špeciálnym povlakom. Keďže každá zlúčenina vo vzorke sa na povlak prilepí iným spôsobom, každá zlúčenina vychádza z trubice v inom čase. Povlak sa teda používa na oddelenie každej zlúčeniny, ktorá bola vo vzorke zmiešaná. Keď každá zlúčenina vychádza na konci trubice, je ionizovaná a získava elektrický náboj. Väčšina zlúčenín sa po ionizácii rozpadne. Jednotlivé kúsky preletia pod magnetom, ktorý ich oddelí na základe ich hmotnosti a náboja. Počítač potom zmeria všetky časti každej zlúčeniny. Porovnaním meraní s počítačovou knižnicou známych zlúčenín počítač vytvorí zoznam názvov všetkých zlúčenín vo vzorke. Počítač tiež dokáže určiť, koľko každej zlúčeniny bolo vo vzorke.

Prístrojové vybavenie

GC-MS sa skladá z dvoch hlavných stavebných prvkov: plynového chromatografu a hmotnostného spektrometra. Plynový chromatograf využíva kapilárnu kolónu, ktorá závisí od rozmerov kolóny (dĺžka, priemer, hrúbka vrstvy), ako aj od vlastností fázy (napr. 5 % fenylpolysiloxán). Rozdiel v chemických vlastnostiach medzi rôznymi molekulami v zmesi oddelí molekuly, keď vzorka prechádza po dĺžke kolóny. Molekuly potrebujú rôzny čas (nazývaný retenčný čas), aby vyšli z plynového chromatografu (eluovali sa z neho). To umožňuje hmotnostnému spektrometru, ktorý sa nachádza za ním, zachytiť, ionizovať, urýchliť, vychýliť a detegovať ionizované molekuly oddelene. Hmotnostný spektrometer to robí tak, že každú molekulu rozdelí na ionizované fragmenty a tieto fragmenty detekuje pomocou ich pomeru hmotnosti a náboja.

Tieto dva prístroje používané spoločne umožňujú oveľa presnejšiu identifikáciu látok ako každá z jednotiek používaných samostatne. Samotnou plynovou chromatografiou alebo hmotnostnou spektrometriou nie je možné vykonať presnú identifikáciu konkrétnej molekuly. Proces hmotnostnej spektrometrie si zvyčajne vyžaduje veľmi čistú vzorku. V minulosti sa pri plynovej chromatografii používali iné detektory, napríklad plameňový ionizačný detektor. Tieto detektory nedokážu oddeliť rôzne molekuly, ktorým náhodou trvá cesta cez kolónu rovnako dlho. (Keď majú dve rôzne molekuly rovnaký retenčný čas, hovorí sa, že "koelujú".) Koelutujúce molekuly zmätú počítačové programy, ktoré čítajú jedno hmotnostné spektrum pre obe molekuly.

Niekedy môžu mať dve rôzne molekuly podobný vzor ionizovaných fragmentov v hmotnostnom spektrometri (hmotnostné spektrum). Kombinácia týchto dvoch procesov znižuje možnosť chyby. Je veľmi nepravdepodobné, že by sa dve rôzne molekuly správali rovnako v plynovom chromatografe aj v hmotnostnom spektrometri. Preto ak sa hmotnostné spektrum zhoduje so záujmovým analytom, retenčný čas tohto spektra sa môže porovnať s charakteristickým retenčným časom GC, aby sa zvýšila istota, že analyt je vo vzorke.

Typy detektorov hmotnostného spektrometra

Najbežnejším typom MS spojeným s GC je kvadrupólový hmotnostný spektrometer. Spoločnosť Hewlett-Packard (teraz Agilent) ho predáva pod obchodným názvom "Hmotnostne selektívny detektor" (MSD). Ďalším pomerne bežným detektorom je hmotnostný spektrometer s iónovou pascou. Okrem toho možno nájsť hmotnostný spektrometer s magnetickým sektorom. Tieto konkrétne prístroje sú však drahé a objemné a zvyčajne sa nenachádzajú vo vysoko výkonných servisných laboratóriách. Používajú sa aj iné detektory, ako napríklad detektor času letu (TOF), tandemové kvadrupóly (MS-MS) (pozri ďalej) alebo v prípade MS s iónovou pascou ⁿ. Písmeno n označuje počet stupňov hmotnostnej spektrometrie.

Vnútro GC-MS s kolónou plynového chromatografu v peci vpravo.


Schéma GC-MS

Analýza

Hmotnostný spektrometer sa zvyčajne používa jedným z dvoch spôsobov: Úplné skenovanie alebo selektívne monitorovanie iónov (SIM). Typický GC-MS môže pracovať samostatne alebo oboma spôsobmi súčasne.

Úplné skenovanie MS

Pri zbere údajov v režime úplného skenovania sa vyberie cieľový rozsah hmotnostných fragmentov a vloží sa do metódy prístroja. Príkladom typického širokého rozsahu sledovaných hmotnostných fragmentov je m/z 50 až m/z 400. Určenie rozsahu, ktorý sa má použiť, je do veľkej miery dané tým, čo sa očakáva vo vzorke, pričom sa berie do úvahy rozpúšťadlo a iné možné interferencie. Ak MS hľadá hmotnostné fragmenty s veľmi nízkymi m/z, môže odhaliť vzduch alebo iné možné rušivé faktory. Použitie veľkého rozsahu skenovania znižuje citlivosť prístroja. Prístroj vykoná menej skenovaní za sekundu, pretože každé skenovanie bude trvať dlhšie, aby sa zistil širší rozsah hmotnostných fragmentov.

Úplné skenovanie je užitočné pri stanovení neznámych zlúčenín vo vzorke. Poskytuje viac informácií ako SIM, keď ide o potvrdenie alebo rozlíšenie zlúčenín vo vzorke. Väčšina prístrojov je riadená počítačom, ktorý obsluhuje počítačový program nazývaný "metóda prístroja". Metóda prístroja riadi teplotu v GC, rýchlosť skenovania MS a rozsah veľkosti detegovaných fragmentov. Keď chemik vyvíja prístrojovú metódu, posiela testovacie roztoky cez GS-MS v režime úplného skenovania. Tým sa skontroluje retenčný čas GC a odtlačok hmotnostného fragmentu pred prechodom na prístrojovú metódu SIM. Špecializované prístroje GC-MS, ako napríklad detektory výbušnín, majú prístrojovú metódu predinštalovanú z výroby.

Monitorovanie vybraných iónov

Pri monitorovaní vybraných iónov (SIM) sa prístrojová metóda zameriava na určité iónové fragmenty. Hmotnostný spektrometer detekuje len tieto hmotnostné fragmenty. Výhodou SIM je, že detekčný limit je nižší, pretože prístroj počas každého skenovania sleduje len malý počet fragmentov (napr. tri fragmenty). Každú sekundu sa môže uskutočniť viac skenovaní. Keďže sa sleduje len niekoľko hmotnostne zaujímavých fragmentov, interferencie matrice sú zvyčajne nižšie. Na zvýšenie šance na správne odčítanie pozitívneho výsledku sú iónové pomery rôznych hmotnostných fragmentov porovnateľné so známym referenčným štandardom.

Typy ionizácie

Po prekonaní dĺžky kolóny, prechode cez prenosovú linku a vstupe do hmotnostného spektrometra sa molekuly ionizujú rôznymi metódami. Zvyčajne sa v danom čase používa len jedna ionizačná metóda. Keď je vzorka fragmentovaná, detekuje sa zvyčajne pomocou elektrónovej násobiacej diódy. Dióda spracúva ionizovaný hmotnostný fragment ako elektrický signál, ktorý sa potom detekuje.

Chemici si vyberajú techniku ionizácie oddelene od výberu monitorovania Full Scan alebo SIM.

Elektrónová ionizácia

Najbežnejším typom ionizácie je elektrónová ionizácia (EI). Molekuly vstupujú do MS (zdrojom je kvadrupól alebo samotná iónová pasca v MS s iónovou pascou), kde na ne dopadajú voľné elektróny emitované z vlákna. Ide o vlákno, ktoré sa nachádza v štandardnej žiarovke. Elektróny zasiahnu molekuly a spôsobia ich fragmentáciu charakteristickým spôsobom, ktorý sa môže opakovať. Výsledkom tejto techniky "tvrdej ionizácie" je vytvorenie väčšieho počtu fragmentov s nízkym pomerom hmotnosti a náboja (m/z). EI má len málo fragmentov, ak vôbec nejaké, ktoré majú hmotnosť blízku hmotnosti pôvodnej molekuly. Chemici považujú tvrdú ionizáciu za streľbu elektrónov do molekúl vzorky. Naproti tomu "mäkká ionizácia" je umiestnenie náboja na molekulu vzorky jej zasiahnutím zavedeným plynom. Vzor fragmentácie molekúl závisí od energie elektrónov aplikovanej na systém, zvyčajne 70 eV (elektrónvoltov). Použitie 70 eV pomáha porovnať spektrá vygenerované z testovanej vzorky so známymi spektrami z knižnice. (Knižničné spektrá môžu pochádzať zo softvéru dodaného výrobcom alebo zo softvéru vyvinutého Národným inštitútom pre štandardy (NIST-USA)). Softvér vyhľadáva spektrá z knižnice pomocou porovnávacieho algoritmu, ako je napríklad porovnávanie na základe pravdepodobnosti alebo porovnávanie bodového súčinu. Mnohé agentúry pre štandardizáciu metód v súčasnosti kontrolujú tieto algoritmy a metódy, aby sa zabezpečila ich objektivita.

Chemická ionizácia

Pri chemickej ionizácii (CI) sa do hmotnostného spektrometra vkladá plynné činidlo, zvyčajne metán alebo amoniak. Existujú dva typy CI: pozitívna CI alebo negatívna CI. V oboch prípadoch reagenčný plyn interaguje s elektrónmi a analytom a spôsobí "mäkkú" ionizáciu molekuly záujmu. Mäkká ionizácia fragmentuje molekulu v nižšej miere ako tvrdá ionizácia EI. Chemici uprednostňujú CI pred EI. Je to preto, že CI vytvára aspoň jeden hmotnostný fragment s hmotnosťou, ktorá je takmer rovnaká ako molekulová hmotnosť analyzovanej látky.

Pozitívna chemická ionizácia

Pri pozitívnej chemickej ionizácii (PCI) reagujúci plyn interaguje s cieľovou molekulou, najčastejšie výmenou protónov. Tým sa produkujú iónové druhy v relatívne vysokých množstvách.

Negatívna chemická ionizácia

Pri negatívnej chemickej ionizácii (NCI) plynné činidlo znižuje dopad voľných elektrónov na cieľový analyt. Táto znížená energia zvyčajne zanecháva fragment vo veľkej zásobe. (Fragmenty sa ďalej nerozpadajú.)

Výklad

Hlavným cieľom prístrojovej analýzy je zmerať množstvo látky. To sa vykonáva porovnaním relatívnych koncentrácií medzi atómovými hmotnosťami vo vytvorenom hmotnostnom spektre. Možné sú dva druhy analýzy, porovnávacia a pôvodná. Porovnávacia analýza v podstate porovnáva dané spektrum s knižnicou spektier, aby sa zistilo, či sú jeho charakteristiky prítomné pre nejakú známu vzorku v knižnici. Túto činnosť najlepšie vykonáva počítač, pretože v dôsledku zmien mierky môže dôjsť k mnohým vizuálnym skresleniam. Počítače môžu tiež korelovať viac údajov (napríklad retenčné časy identifikované GC), aby sa presnejšie prepojili určité údaje.

Iná metóda analýzy meria vrcholy vo vzájomnom vzťahu. Pri tejto metóde je najvyšší vrchol nastavený na 100 %. Ostatným píkom sa priradí hodnota rovnajúca sa pomeru výšky píku k výške najvyššieho píku. Priradia sa všetky hodnoty nad 3 %. Celková hmotnosť neznámej zlúčeniny sa zvyčajne uvádza pri materskom píku. Hodnota tohto materského píku sa môže použiť na dosadenie do chemického vzorca obsahujúceho rôzne prvky, o ktorých sa predpokladá, že sa v zlúčenine nachádzajú. Izotopový vzorec v spektre je jedinečný pre prvky, ktoré majú veľa izotopov. Môže sa teda použiť aj na identifikáciu rôznych prítomných prvkov. Týmto sa dá zistiť celkový chemický vzorec neznámej molekuly. Keďže štruktúra molekuly a väzby sa rozpadajú charakteristickými spôsobmi, možno ich identifikovať na základe rozdielu v hmotnostiach píkov. Identifikovaná štruktúra molekuly musí byť v súlade s charakteristikami zaznamenanými pomocou GC-MS. Zvyčajne sa táto identifikácia vykonáva automaticky pomocou počítačových programov, ktoré sa dodávajú s prístrojom. Tieto programy porovnávajú spektrá s knižnicou známych zlúčenín, ktoré majú rovnaký zoznam prvkov, ktoré by mohli byť prítomné vo vzorke.

Pri analýze "celého spektra" sa zohľadňujú všetky "vrcholy" v rámci spektra. Pri selektívnom monitorovaní iónov (SIM) sa však sledujú len vybrané píky spojené s konkrétnou látkou. Chemici predpokladajú, že v danom retenčnom čase je súbor iónov charakteristický pre určitú zlúčeninu. SIM je rýchla a efektívna analýza. SIM funguje najlepšie, keď má analytik predchádzajúce informácie o vzorke alebo hľadá len niekoľko špecifických látok. Keď sa množstvo získaných informácií o iónoch v danom plynovom chromatografickom píku zníži, citlivosť analýzy sa zvýši. SIM analýza teda umožňuje detekovať a merať menšie množstvo zlúčeniny. Znižuje sa však miera istoty o identite tejto zlúčeniny.

GC-tandemová MS

Ak sa pridá druhá fáza hmotnostnej fragmentácie, napríklad pomocou druhého kvadrupólu v kvadrupólovom prístroji, nazýva sa tandemová MS (MS/MS). MS/MS sú dobré na meranie nízkych hladín cieľových zlúčenín vo vzorke s matricou zlúčenín v pozadí, ktoré nie sú predmetom záujmu.

Prvý kvadrupól (Q1) je spojený s kolíznou bunkou (q2) a ďalším kvadrupólom (Q3). Oba kvadrupóly sa môžu používať v skenovacom alebo statickom režime v závislosti od typu použitej analýzy MS/MS. Medzi typy analýzy patrí skenovanie iónov produktu, skenovanie iónov prekurzora, monitorovanie vybraných reakcií (SRM) a skenovanie neutrálnych strát. Napríklad: Keď je Q1 v statickom režime (sleduje sa len jedna hmotnosť ako pri SIM) a Q3 je v skenovacom režime, získa sa tzv. produktové iónové spektrum (nazývané aj "dcérske spektrum"). Z tohto spektra možno vybrať výrazný produktový ión, ktorý môže byť produktovým iónom pre zvolený prekurzorový ión. Táto dvojica sa nazýva "prechod" a tvorí základ SRM. SRM je vysoko špecifická a takmer úplne eliminuje matricové pozadie.

Aplikácie

Monitorovanie a čistenie životného prostredia

Mnohí chemici sa domnievajú, že GC-MS je najlepším nástrojom na monitorovanie organických znečisťujúcich látok v životnom prostredí. Náklady na vybavenie GC-MS sa veľmi znížili. Zároveň sa zvýšila spoľahlivosť GC-MS. Obe zlepšenia zvýšili používanie v environmentálnych štúdiách. Niektoré zlúčeniny, ako napríklad niektoré pesticídy a herbicídy, nie je možné identifikovať pomocou GS-MS. Sú príliš podobné iným príbuzným zlúčeninám. Na väčšinu organických analýz environmentálnych vzoriek vrátane mnohých hlavných tried pesticídov je však GC-MS veľmi citlivá a účinná.

Kriminalistika

GC-MS môže analyzovať častice z ľudského tela, aby pomohla spojiť zločinca s trestným činom. Zákon pripúšťa použitie GC-MS na analýzu zvyškov po požiari. Americká spoločnosť pre testovanie materiálov (ASTM) má v skutočnosti normu na analýzu požiarnych zvyškov. GCMS/MS je tu obzvlášť užitočná, pretože vzorky často obsahujú veľmi zložité matrice a výsledky, ktoré sa používajú na súde, musia byť veľmi presné.

Orgány činné v trestnom konaní

GC-MS sa používa na odhaľovanie nelegálnych drog a časom môže nahradiť psy na vyhľadávanie drog. Bežne sa používa aj vo forenznej toxikológii. Pomáha nájsť drogy a/alebo jedy v biologických vzorkách odobratých podozrivým, obetiam alebo mŕtvemu telu.

Zabezpečenie

Po teroristických útokoch z 11. septembra 2001 sa systémy na detekciu výbušnín stali súčasťou všetkých amerických letísk. Tieto systémy využívajú množstvo technológií, z ktorých mnohé sú založené na GC-MS. Na poskytovanie týchto systémov majú od FAA certifikát len traja výrobcovia. Prvým je spoločnosť Thermo Detection (predtým Thermedics), ktorá vyrába systém EGIS, rad detektorov výbušnín na báze GC-MS. Druhou je spoločnosť Barringer Technologies, ktorú teraz vlastní spoločnosť Smith's Detection Systems. Treťou je spoločnosť Ion Track Instruments (súčasť General Electric Infrastructure Security Systems).

Analýza potravín, nápojov a parfumov

Potraviny a nápoje obsahujú veľa aromatických zlúčenín, z ktorých niektoré sú prirodzene prítomné v surovinách a niektoré vznikajú počas spracovania. GC-MS sa vo veľkej miere používa na analýzu týchto zlúčenín, ktoré zahŕňajú estery, mastné kyseliny, alkoholy, aldehydy, terpény atď. Používa sa aj na zisťovanie a meranie kontaminantov pochádzajúcich z kazenia alebo falšovania, ktoré môžu byť škodlivé. Kontaminanty sú často kontrolované vládnymi agentúrami, napríklad pesticídy.

Astrochémia

Niekoľko GC-MS opustilo Zem. Dve sa vydali na Mars v rámci programu Viking. Venera 11 a 12 a Pioneer Venus analyzovali atmosféru Venuše pomocou GC-MS. Sonda Huygens v rámci misie Cassini-Huygens vysadila jeden GC-MS na najväčšom Saturnovom mesiaci Titan. Materiál v kométe 67P/Churyumov-Gerasimenko bude v roku 2014 analyzovať misia Rosetta pomocou chirálneho GC-MS.

Medicína

GC-MS sa používajú pri skríningových testoch novorodencov. Tieto testy môžu odhaliť desiatky vrodených metabolických ochorení (známych aj ako vrodené chyby metabolizmu). GC-MS dokáže stanoviť zlúčeniny v moči aj vo veľmi malých množstvách. Tieto zlúčeniny sa za normálnych okolností nevyskytujú, ale objavujú sa u jedincov trpiacich metabolickými poruchami. Toto sa stáva bežným spôsobom diagnostiky IEM pre skoršiu diagnostiku a začatie liečby. To v konečnom dôsledku vedie k lepším výsledkom. V súčasnosti je možné testovať novorodenca na viac ako 100 genetických metabolických porúch pomocou testu moču pri narodení na základe GC-MS.

V kombinácii s izotopovým značením metabolických zlúčenín sa GC-MS používa na stanovenie metabolickej aktivity. Väčšina aplikácií je založená na použití ¹³C ako značenia a meraní pomerov ¹³C-¹² C pomocou hmotnostného spektrometra s izotopovým pomerom (IRMS). IRMS je hmotnostný spektrometer s detektorom určený na meranie niekoľkých vybraných iónov a vrátenie hodnôt ako pomerov.